Qual o componente sanguíneo humano se obtém material para análise de DNA?

Alguns anos atrás, quando assistíamos filmes policiais, aqueles que já têm mais de 30 anos, ficávamos surpresos com a descoberta de quem era o assassino, após que o detetive levava para analisar algum cabelo, os traços de saliva em uma ponta de cigarro.... incrível!

Hoje (mais uma vez) a ciência ultrapasso a ficção, e podemos determinar quem é o assassino, pai, a avó e a amante de uma pessoa através de testes de DNA !

Mas ... vamos rever um pouco ...

O que é DNA?

DNA ou ADN é a abreviatura de Ácido Desoxirribonucléico (desoxirribonucleico, na ortografia africana e europeia). É a molécula que constitui os nossos genes. É transmitida de uma geração para outra e permanece inalterada ao longo de nossas vidas. No entanto, cada pessoa tem uma combinação única que herdou em partes iguais (50% e 50%) do pai e da mãe.

Bem, a maioria sabe que o mais fácil, simples e pode até dizer tradicional para obter uma amostra para um exame de DNA, é através da extração de sangue num laboratório. Como a maior parte das análises!

Hoje fazer um TESTE DE DNA é cada vez mais comum, pelo fato de que os valores são mais accessíveis e pela necessidade que as pessoas querem ter a informação 100% segura e confiável de quem é, ou quem são as pessoas que fazem parte da sua família. É por isso que hoje em dia comprar um kit de paternidade se torno a maneira mais rápida e simples de fazer o exame na sua casa.  Só precisa uma amostra de saliva com um cotonete das pessoas, e enviar as amostras para o laboratório. Os prazos para os resultados são muito curtos (5 dias) e você acaba com o mistério. Mas...

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Como fazer um teste de DNA com outras amostras se não tenho possibilidade de colocar um cotonete na boca da outra pessoa?

Como todas as nossas células contêm a informação genética, portanto, pode analisar e comparar qualquer delas (desde que não sejam contaminados) cortes de unhas (que sempre têm um resíduo de pele), sangue seco que foi deixado em uma peça de roupa ou de papel, saliva em um copo de plástico ou cera de ouvido em um cotonete, chicletes e muitos mais exemplos podem ser vistos aqui.

Vamos ver um exemplo concreto de uma análise de DNA, o Teste de Paternidade, que é a análise genética mais barata  e com mais demanda hoje :

Para realizar o teste de paternidade primeira coisa a fazer é estudar o DNA, que é a informação genética, de cada um dos pais, por meio de uma técnica chamada PCR em que a sequência da informação genética é analisada. Com uma amostra da mãe (alguns dos quais discutimos anteriormente), uma amostra do filho e uma amostra do suposto pai. O teste baseia-se na comparação entre os genes que compõem o DNA. O grau de coincidência deve ser total, se não for, a legitimidade paterna é excluída. Se todos os genes coincidirem, então afirma-se que o suposto pai é verdadeiro com grau de certeza acima de 99,99%.

Espero que você goste do meu post!

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A maior parte dos métodos que existem para extrair ADN consistem na promoção da lise, ou ruptura celular, para que o isolamento do ADN do resto dos constituintes da célula seja possível.

Aquando da escolha do método de extracção de ADN a utilizar, vários factores devem ser tidos em conta:

• A quantidade de amostra de que se dispõe para a extracção do ADN.

• O tipo de amostra ou fonte da qual se quer extrair o ADN.

• O grau de pureza com que se quer obter o ADN extraído.

• O tempo que cada método consome, o seu custo e rendimento esperado.

• O uso que se vai dar ao ADN extraído.

Com a diversidade de métodos conhecidos actualmente, pode extraír-se ADN de vários substratos, tais como o sangue, a saliva, a urina e outros fluídos corporais, tecidos vivos, culturas de células, líquido amniótico, entre outros. Neste trabalho são analisadas as diferenças, vantagens e desvantagens de alguns dos métodos existentes para a extracção do ADN.

Incubação do lisado para o seu uso

Uma forma possível de isolar o ADN genómico é incubar o lisado em bruto a temperaturas entre 90 – 100ºC e usá-lo directamente. Evidentemente, mediante este método o ADN obtido apresenta um reduzido grau de pureza e número de aplicações. Outra desvantagem deste método são as perdas de ADN por acção das nucleases e outros componentes dos organelos que estão em contacto com o ADN e podem destruí-lo. Não permite armazenar o ADN, dado que os contaminantes podem degradar as suas moléculas.

Lise por ruptura mecânica e extracção com solventes mecânicos

Se se opta obter o lisado celular recorrendo a um processo mecânico, deve-se ter em conta a possibilidade de ruptura das moléculas de ADN que se tentam separar, pelo que este deve ser suficiente para que se alcance a lise celular mas não ser muito agressivo, para proteger o ADN. Este método pode ser utilizado para extrair ADN de material cru, liofilizado ou congelado, que pode romper-se com uma argamassa, por congelação-descongelação ou utilizando ultrasons. O lisado celular pode ser extraído com clorofórmio, álcool isoamílico ou fenol, sendo as proteínas e outros componentes da célula solúveis num solvente orgânico, pelo que desta forma se possibilita a separação dos ácidos nucléicos. Este método pode utilizar-se para moléculas de ADN de alto peso molecular, obtendo bons rendimentos de moléculas relativamente puras, tendo-se sempre em conta que se deve controlar o pH da fase aquosa e a concentração de sais, que são os factores que asseguram uma boa separação. As desvantagens deste método são o uso de solventes orgânicos nocivos para a saúde humana que podem ficar como vestígios na amostra de ADN e actuar, interferindo em técnicas como o PCR que é longo e em certos casos pode levar a rendimentos pouco reproduzíveis e requer várias transferências que aumentam a possibilidade de contaminação da amostra.

Lisado e purificação com um detergente iónico. Método de CTAB

Este é um procedimento básico para extraír ADN de vegetais, assenta no uso de um detergente aniónico que dissolve a parede celular atingindo-se assim a lise celular. O uso de detergentes aniónicos não se limita apenas à extracção de ADN vegetal, podendo também ser utilizado para a extracção de ADN genómico de bactérias e outros tipos de organismos. Um exemplo deste método, talvez o mais conhecido é o uso de CTAB (brometo de cetil trimetil de amónia) como detergente para a obtenção da lise. Para além disto o CTAB, na presença de EDTA como agente quelante e TRIS-HCl como tampão, forma complexos insolúveis com o ADN.1a Extraem-se de seguida os resíduos orgânicos com clorofórmio para separar, posteriormente, o ADN por precipitação com etanol. Se se quiser evitar o uso de solventes orgânicos pode-se levar a cabo o método do CTAB, separando directamente os complexos insolúveis formados com o ADN do sobrenadante onde ficaram dissolvidos o resto dos constituintes celulares. Estes complexos ficam suspensos em solução salina e adiciona-se álcool e RNAse, conseguindo-se a precipitação de ADN com um grau de pureza aceitável para muitas aplicações.

Método de salting-out

A partir de um lisado celular pode separar-se o ADN das proteínas e de outros contaminantes do ADN recorrendo à adição de altas concentrações salinas que levam à redução da solubilidade das moléculas orgânicas na fase aquosa.2a Neste método utiliza-se frequentemente a proteinase K, o TRIS-HCl para regular o pH e outros reagentes de laboratório que asseguram a total inactivação das enzimas que podem actuar sobre as moléculas de ADN. Para a extracção utilizam-se sais orgânicos como o perclorato de sódio em concentrações muito altas que fazem precipitar as moléculas orgânicas. O precipitado formado separa-se por centrifugação e pode, de seguida, extrair-se o ADN da solução aquosa mediante a adição de álcool, por precipitação. Este método é útil, mas nem sempre é eficaz, pelo que o ADN obtido deve, em muitos casos, ser purificado antes de ser novamente utilizado. A vantagem é que não é necessário recorrer à utilização de solventes orgânicos.

Utilização da proteinase K e dodecilsulfato de sódio

O procedimento conhecido como PK-SDS (sigla em inglês para proteinase K – sodium dodecyl sulfate), é um dos mais utilizados para a extracção de ADN, já que a digestão da amostra pode realizar-se com proteinase K, que é activada pelo dodecil sulfato de sódio. A proteinase K torna as DNAses presentes no lisado celular inactivas recorrendo ao detergente aniónico SDS.3a A proteinase K é também utilizada para a digestão das proteínas e de outros contaminantes do lisado celular noutros métodos descritos neste artigo.

Método de extracção de ADN com iodeto de sódio como agente caotrópico num único tubo

A empresa Wako põe à disposição dos investigadores e empresas vários kit de extração de DNA que usam iodeto de sódio como agente caotrópico, com a vantagem da extracção se realizar num único micro tubo de centrifugação. Para além de provocar a lise celular, o iodeto de sódio rompe também a capa de hidratação que envolve o ADN e que possibilita que as cargas negativas dos grupos fosfatos do ADN fiquem mais expostas. Nestes kits, após o tratamento da amostra com iodeto de sódio, adicionam-se no mesmo tubo detergentes aniónicos tais como o N-lauril sacrosinato de sódio, proteinase K e/ou outros reagentes que permitem separar as proteínas e lípidos contidos nas amostras biológicas de ADN.

Entre os kits comercializados pela Wako existem:

• Kit de extracção de ADN (DNA Extractor® Kit) para extrair ADN tanto de soro sanguíneo como de productos biofarmacêuticos.

• Kit de extração de ADN WB ( DNA Extractor® WB Kit) para a extracção de ADN genómico de amostras de sangue inteiras.

• Kit de extração de ADN TIS (DNA Extractor® TIS Kit) este kit pode ser utilizado para a extracção de ADN de tecido parenquimatoso humano e animal.

• Kit de extração de ADN SP (DNA Extractor® SP Kit) utilizando este kit pode extrair-se o ADN livre de soro e plasma sanguíneo.

• Kit isolador de ADN PS (DNA Isolator PS Kit) permite isolar o ADN em amostras de secções de tecidos embebidas ou incrustadas em parafina.

• Kit de extração de ADN FM (DNA Extractor® FM Kit) utiliza-se principalmente para a obtenção de ADN em amostras de medicina forense.

Extracção com gradientes de cloreto de cesio – brometo de etidio

O ADN genómico pode ser purificado por centrifugação selectiva através da criação de gradientes de cloro de césio. Em primeiro lugar obtem-se o lisado celular por métodos mecânicos ou químicos, e a mistura á centrifugada durante várias horas na presença de brometo de etídio. Como há brometo de etídio no centro, podem observar-se com luz ultravioleta as diferentes camadas nas quais se agrupam os ácidos nucléicos segundo a sua densidade. Obtêm-se várias camadas que podem separar-se e recuperar o ADN purificado.

Este método, apesar de permitir obter ADN de alta qualidade, apresenta várias desvantagens: é longo, impossível de automatizar, caro, requer uma ultracentrifugadora e utiliza compostos químicos tóxicos.

Troca aniónica para a extracção de ADN do lisado celular

A cromatografia em fase sólida de troca aniónica baseia-se na interacção que se estabelece entre os grupos fosfatos com carga negativa do ADN e na matriz molecular em que a coluna se compacta. Esta interacção faz com que as moléculas de ADN fiquem retidas na fase estacionária da coluna e possam separar-se das proteínas e outros metabolitos presentes. Se se adicionar de seguida uma alta concentração de sais na fase móvel, consegue-se evitar os casos em que o ADN necessita de precipitar com álcool para futuras aplicações e em que não se pode utilizar directamente dissolvido no buffer, com os sais no qual foi dissolvido. Este método tem a vantagem de não utilizar solventes orgânicos tóxicos e é mais simples do que os que requerem precipitação de outros componentes para a separação destes do ADN.

Uso de matrizes celulósicas para a extracção de ADN de amostras biológicas

Um método utilizado em investigações forenses consiste em impregnar uma matriz de celulose com produtos químicos que permitam a lise celular e posterior conservação do ADN. Para isto unem-se tampões, agentes quelantes, sais, detergentes e moléculas com grande absorção dos UV para proteger as amostras dos radicais livres que se podem formar pela exposição à luz solar. Seguindo este procedimento, as amostras podem ser conservadas por um grande período de tempo, o que é muito útil para a resolução de casos forenses e também tem utilidade na determinação de espécies num fluído corporal, como por exemplo um vírus ou uma bactéria.4

Uso de resinas de troca iónica

Para a extracção do ADN também se criaram resinas capazes de formar complexos com o ADN. O uso de resinas hidrocarbonadas com estruturas rígidas a três dimensões permite que a superfície possa conter alguma substância, como por exemplo o dietilaminoetilo que pode oxidar-se num meio ácido e ficar carregado positivamente, reagindo com os grupos fosfato do ADN. Este é um método directo, relativamente rápido e que pode realizar-se num só tubo, tendo no entanto como inconvenientes o facto de se isolarem cadeias simples de ADN e este não poder ser utilizado, por exemplo, para análise da variação de polimorfismos em fragmentos de restrição (RFLP).

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